Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

产品信息


产品名称

产品编号

规格

价格(元)

Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

11121ES60

100 T

935.00


产品描述


Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase而开发。该酶热稳定性大幅度提高,可耐受高达50℃的反应温度,适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时,该酶增强了与模板的亲和力,适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair® Ⅱ Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升,可扩增长达10 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester,可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染,保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供两种cDNA合成引物:Random Primers N6 和oligo (dT)18,用户可根据需要,选择Random Primers N6,Oligo (dT)18或Gene Specific Primers作为逆转录引物,合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。


产品组分


编号

组分

产品编号(规格) 11121ES60 (100 T)

11121-A

RNase free ddH2O

1 mL×2

11121-B

5×gDNA digester Buffer

200 μL

11121-C

gDNA digester

100 μL

11121-D

5×Hifair® Ⅱ Buffer plus

400 μL

11121-E

Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

200 μL

11121-F

Oligo (dT)18 (50 μM)

100 μL

11121-G

Random Primers N6 (50 μM)

100 μL

【注】:1)5×Hifair® Ⅱ Buffer plus包含gDNA digester抑制剂和dNTP;2)Hifair® Ⅱ Enzyme Mix包含RNase inhibitor。


运输与保存


冰袋运输。-20℃保存,有效期18个月。


注意事项


1)反应液的配制应在冰上操作完成,操作过程应避免RNase污染

2)建议RNA是溶于水而不是TE因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应

3)可以不经过基因组去除步骤,直接进行逆转录,这样所得到的结果与使用Hifair® Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis KitCat No. 11119ES)效果一致。但是请勿将gDNA digester11119ES中的5×Hifair® Ⅱ Buffer配套使用,因其不含终止gDNA 去除反应的成分,会影响反转录和后续的qPCR实验。


关于逆转录引物的选择


1) 如果模板为真核生物来源,建议选择Oligo (dT)18 ,与真核生物mRNA3’ Poly A尾配对,可获得高产量的全长cDNA 

2)原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3Random Primers N6适用性较广,适用于mRNArRNAtRNAsmall RNALncRNA等模板

4使用Random primers N6,进行2 kb以下的cDNA合成时,Random primers N6的使用量为 1-2 μL2 kb 以上的cDNA合成时,Random primers N6 的使用量为0.4-1 μL。


第一链cDNA合成操作步骤


一、若实验需要去除残留基因组DNA


1. 在RNase free离心管中配制如下混合液,用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

组分

使用量

RNase free ddH2O

To 10 μL

5× gDNA digester Buffer

2 μL

gDNA digester

1 μL

模板RNA

Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA: 1 ng-500 ng


2. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

RNase free ddH2O

To 20 μL

上一步的反应液

10 μL

5× Hifair® Ⅱ Buffer plus

2 μL*

Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

2 μL

Random Primers N6 (50 μM)  

1 μL

or Oligo (dT)18 (50 μM)

or Gene Specific Primers (2 μM)

or 1 μL

or 1 μL

【注】:

1)逆转录引物:荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。

25×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量(*)gDNA digester buffer的影响,本体系中只需要加2 μL

3)建议先加入5×Hifair® Ⅱ Buffer plus混匀后再添加反转录引物,以保证完全抑制gDNA digester的活性。


3. 逆转录程序设置

温度

时间

25℃

5 min

42℃

30 min

85℃

5 min

】:逆转录温度:推荐使用42。对于高GC含量模板或者复杂模板,可将逆转录温度提高到50


4. 逆转录产物可以-20℃短期保存,若需长期保存,建议分装后,于-80℃保存,避免反复冻融。


二、若实验无需去除基因组DNA


1. 逆转录反应体系配制(20 μL体系)

组分

使用量

RNase free ddH2O

To 20 μL

模板RNA

Total RNA: 1 ng -5 μg或mRNA: 1 ng-500 ng

5× Hifair® Ⅱ Buffer plus

4 μL*

Oligo (dT)18 (50 μM) or Random Primers N6 (50 μM)

1 μL

Hifair® Ⅱ Enzyme Mix

2 μL

【注】:

1)逆转录引物:荧光定量实验推荐Random Primers N6与Oligo (dT)18 1:1混合使用。

2)5×Hifair® Ⅱ Buffer plus加入量(*):因无gDNA digester buffer的影响,本体系中需要添加4 μL。

【可选步骤】:针对复杂模板,建议RNA、H2O、反转录引物在65℃保温5 min 后,冰上迅速冷却。然后再加入反转录酶和Buffer。


2. 逆转录程序设置参照上述基因组去除后的逆转录程序。

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